培养基的制备及器具灭菌

一、目的要求：
了解培养基的配制过程及常用的灭菌方法。
二、培养基的配制
凡具有各种营养物质适宜微生物生长繁殖的基质，叫培养基。培养基的种类很多，依其常温下物理状态分为：固体培养基。半固体培养基及液体培养基；依其组份来源分为：天然培养基、合成培养基及半合成培养基。在植病方面常用的有两种半合成培养基，一种是马铃薯洋菜胶培养基（简称PDA培养基）此种多用于培养真菌及其它的微生物。另一种是牛肉质蛋白培养基（牛肉浸膏3克，蛋白5-10克，葡萄糖或蔗糖10克，洋菜胶17-20克，水1000毫升）。这一种主要用于培养细菌。
1．PDA培养基配方：
马铃薯200克，蔗糖或葡萄糖10-20克，洋菜胶15-20克，水1000毫升。
2．配制过程：
将马铃薯洗净去皮切成小块，加水1000毫升，煮沸30分钟，用纱布过滤并补足水量，加入糖及洋菜胶，加热使洋菜完全溶化，再补足水量至1000毫升，然后分装在三角瓶（作平面分离用）或试验内（每管5毫升；用作斜面培养用），注意分装时，不能使培养基粘附在管口或瓶口上，以免引起杂菌污染，分装好后塞上棉塞，包上油纸进行灭菌。
3．灭菌：把上面配好的培养基置于灭菌锅（也称高压消毒锅）内，加热使温度升至121℃（这时蒸汽压为15磅）处理20分钟即可达到灭菌目的。
操作步骤及注意事项如下：
①先给灭菌锅内加一定数量水（到指定水线）
②将需要灭菌的物品包扎好管口、瓶口向上放入锅内，注意物品不能挤压过紧，上紧锅盖，打开排气阀门。
③用电炉（或喷灯）加热到锅内空气安全排出后（可见有蒸汽从气门冲出）关闭排气阀。
④当汽压表的指针到121℃即15磅时，开始计算时间，然后控制火源使压力维持在15磅，经20分钟即停止加热。
⑤停止加热后，接着就微微放开气门（注意开始不能让气门安全打开），让蒸汽慢慢排出，使汽压徐徐下降至“零”。若排汽太急，锅内的培养基就沸腾，冲开棉花塞或粘到棉花塞上。排气也不能太慢，因培养基受高温处理时间过长会被破坏。
⑥当压力降至“O”时，再打开锅盖，取出培养基，试管培养基取出后应刻置成斜面，待冷却后即成斜面培养基。
三、玻璃器皿及其它用具灭菌
对玻璃器皿等采用干热灭菌法。即在烘箱中加热至160-170℃，维持1小时，或150℃2小时。器皿放入烘箱前必须干燥，灭菌时应控制温度使其慢慢上升。灭菌后待箱内温度下降至室温后再打开箱门，否则玻璃器皿会突然遇冷而发生破裂。
在无菌操作中所用的金属小型用具如：镊子、剪刀、接种针、接种环等一般都是在使用时，直接用酒精火焰灭菌即可。
四、间歇灭菌法
在无灭菌锅等高压灭菌设备时，培养基可用间歇灭菌法进行灭菌。即在蒸笼（或其它灭菌器）连续蒸三次，每隔一天蒸一次，每次蒸1小时左右。每次蒸煮后将培养基放在精洁干净房间内（温度25-30℃为宜），待细菌的芽孢萌发抗性碱低，在下次灭菌中就会被杀死。一般微生物在60℃处理15分钟或70-80℃处理5-10分钟就可被杀死，但细菌的芽孢在100℃仍可存活，所以通过间歇灭菌法就可达到杀死芽孢的目的。